FPs мають різні біофізичні властивості, включаючи їх тенденція до oligomerize, які можуть вплинути на поведінку їх злиття партнерів в контексті флуоресцентні репортерів. Цей протокол описує простий метод, де кілька кадрів може бути зливається з розкладання токсичних polyQ. Оскільки polyQ токсичність сильно залежить від послідовності фланкіруя polyQ стрейч15, цей assay дозволяє швидке і пряме порівняння флуоресцентний polyQ фьюжн Репортери (рис. 1). HD-неассоціірованние polyQ Довжина (25Q) використовується як негативний контроль і не відображати значну токсичність або агрегірованія15,16,21,22. 72Q використовується для отримання HD-як фенотип, включаючи сильне зростання гальмування і polyQ агрегації. Важливо відзначити, що Httex1 кодування послідовності зайнятих відсутність proline багаті домен, який слідує за polyQ стрейч. Присутності proline багатих домену Httex1 не токсичний в дрожжі15. В цей assay Httex1, зливається з дріжджів оптимізований варіант мономерних superfolder GFP12 (ymsfGFP) 16 використовується як позитивний елемент управління як опісано16. Конструкції також містять тег epitope прапор на N-го Httex1. Це дозволяє виявляти різні сплавліванія з же антитіла (анти прапор) для біохімічного аналізу. Як доказ з принципу 72Q Httex1 зливається з оптимізований дріжджів TagBFP2 (yomTagBFP2) 23 не призводить до повільне зростання вимірюється або пляма аналізів на плитах агару або зростання в рідких середовищах (рис. 2), вказуючи, що природа флуоресцентні мітки можуть дійсно перешкоджають polyQ розширення функціональності в клітинах.

Агрегування сплавліванія флуоресцентний polyQ може бути оцінена за допомогою флуоресцентної мікроскопії. 72Q-ymsfGFP відображає значні агрегування в порівнянні з 25Q. Однак 72-yomTagBFP флуоресцентного сигналу залишається розсіяний всій цитоплазмі (рис. 3). У більшості випадків, не рекомендується використовувати ті ж налаштування отримання зображення (лазерні влади, витримка) придбати зображень 25Q і 72Q. Агрегати в клітинах 72Q-висловлюючи набагато яскравіше, ніж розсіяний 25Q сигнал. Таким чином зображень умовах для отримання зображення 72Q, розсіяний 25Q сигнал може з'являються дуже слабкий або не видно на всіх. Відповідні придбання параметри повинні застосовуватися також до мінімуму насичення під час зйомки 72Q-висловлюючи клітин.

Рівні вирази різних polyQ розплави можуть вплинути на токсичність. Миючий нерозчинні Амілоїди, таких, як агрегатів polyQ, складно вивчити біохімічно і не підходять для аналізу standerd SDS-PAGE. Таким чином точка плями можуть виконуватися для оцінки рівня білка. Включення прапора тега в кінці аміно terminus Httex1 дозволяє виявлення всіх флуоресцентні сплавліванія одночасно, незважаючи на присутність FPs (рис. 4). Крім того для оцінки формування polyQ олігомеров16может виконуватися підлозі денатуруючи пральний порошок окуляри гелю агарози (SDD-вік). Докладний протокол і відео доступні в Halfmann і Ліндквіст24.

Рис 1: Діаграма робочого процесу для аналізу ефекту тега флуоресцентний білок на агрегації і токсичність polyQ розширення білків в дріжджі. По-перше, FPs клонуються в вектори вираження дріжджі кодування галактозо індуцібельной версія прапора тегами Httex1 приховування або 25Q (нетоксичний) або 72Q (HD-пов'язаних, статистичної обробки та токсичних) повторюється. Клони відбираються і перевіряються послідовності і, згодом перетворена в дріжджів. Після інкубації в галактозо містять ЗМІ, плямистість аналізів на плитах агару або рідкі засоби підвищення індукції polyQ фьюжн вираження можна оцінити polyQ токсичності. PolyQ агрегат аналізованої флуоресцентної мікроскопії. Відносне вираження різних конструкцій оцінюється з використанням дот блот. Будь ласка, натисніть тут, щоб подивитися велику версію цієї фігури.

Малюнок 2: Представник зростання пробірного результати після висловлення Httex1 флуоресцентні сплавліванія в дріжджів. Дріжджі, висловлюючи 25Q або 72Q Httex1 зливається з ymsfGFP або yomTagBFP був культивували в глюкози (управління) або галактози засоби масової інформації (polyQ індукованої) на ніч і або (A) помітили на плити агару або (B) далі инкубируют в рідини засоби масової інформації для оцінки зростання в різних умовах. У той час як 72Q-ymsfGFP викликає значне зростання дефекту, 72Q-yomTagBFP відображає зростання фенотип, аналогічний нетоксичний 25Q колегами. Будь ласка, натисніть тут, щоб подивитися велику версію цієї фігури.

Малюнок 3: Представник флуоресцентного зображення Httex1 флуоресцентні сплавліванія в дріжджі. Дріжджі, висловлюючи 25Q або 72Q Httex1 зливається з ymsfGFP або yomTagBFP був культивували в глюкози (управління) або галактози засоби масової інформації (polyQ індукованої) на ніч і образи за допомогою конфокального мікроскопа. У той час як 72Q-ymsfGFP вираз призводить до сильних polyQ агрегації білків, 72Q-yomTagBFP відображає розсіяний цитоплазматических сигнал схожий на нетоксичний 25Q колегами. Будь ласка, натисніть тут, щоб подивитися велику версію цієї фігури.

Малюнок 4: Представник точка блот аналіз Httex1 флуоресцентні фьюжн вираження в дріжджів. Дріжджі, висловлюючи 25Q, 46Q, 72Q або 103Q Httex1 зливається з КФП культивували в ЗМІ галактозу (polyQ індукованої) на ніч і обробляються для аналізу помарки точка. Показуються п'ятикратний розведень lysates клітини. Будь ласка, натисніть тут, щоб подивитися велику версію цієї фігури.