Примітка: Наступний протокол описує всі необхідні кроки для виконання експериментів IR-MALDESI MSI. Поглиблений подробиці про оптимізованої геометрії джерела ІК-MALDESI і його синхронізації з лазерним, стадії, і мас - спектрометр може бути знайдений в іншому місці 5,6. Зразки тканин тварин, що використовуються в цьому документі були отримані відповідно до інституційної догляду та використання тварин комітету (IACUC) і нормативними актами Університету штату Північна Кароліна.

1. Підготовка тканини

1. Підготуйте / ванну сухий лід ізопентан шляхом розміщення ~ 200 мл изопентана в чистому склянці всередині вторинного контейнера сухого льоду в витяжній шафі. Використовуйте захисні рукавички і захисні окуляри у всіх випадках при поводженні з / ванна изопентана сухого льоду і тканини.
   1. Евтаназії 2-денними весь неонатального дитинча миші передозуванням Avertin (7,5 мг / г маси тіла), а потім заморозити тканину в / лазні з сухим льодом изопентана, щоб зберегти структуру тканини. Використовуйте попередньо чістойред пара щипців на місце і видалити цуценя миші в cryomold з / лазні з сухим льодом изопентана. Зберігайте флеш-заморожені тканини при -80 ° С до аналізу.
2. Використовуючи захисні рукавички, нанесіть шар оптимальної температури різання (ОКТ) монтажної середовища для кріостату зразка диска 40 мм. Акуратно помістіть заморожений усієї миші на тримач зразка з покриттям Жовтні дотримуватися миші на диску в потрібній орієнтації для секціонування.
   Примітка: ОСТ використовується виключно для приклеювання тканини до зразка диска для секціонування. Чи не повністю вбудовувати тканини в ОСТ і уникнути надлишку в жовтні, як відомо, мають шкідливий вплив на аналізі MSI. Інші носії, такі як желатин, можуть бути використані для кріо-вбудовувати тканини до нарізки його 9.
3. Помістіть диск (з ОСТ і зріз тканини) на тримачі зразка Пельтьє в кріостату і натисніть кнопку живлення Пельтьє. Зачекайте 10 хвилин для зразка, щоб прийти до теплового рівноваги.
4. Помістіть Зразки диска (з тканиною, встановлений Наона) всередині держателя диска, і особа тканини вниз до потрібної площини для аналізу. Нарізати тканину на ділянки бажаної товщини при -20 ° С з використанням роторного мікротома розміщений всередині кріостату 10.
   Примітка: Для всього тіла аналізу, скибочку тканини в 25 мкм завтовшки секцій для підтримки цілісності тканин. Для менших областей (наприклад, печінку, мозок, нирки), зріз тканини в 10 мкм завтовшки секцій.
   1. Використовуйте скляну пластину стабілізуюча, щоб запобігти розділ нарізану тканини від скочування. За допомогою кріостату вакуумний шланг і щітки для видалення сміття небажаної тканини. Після того, як тканину розрізали, використовуйте захисний кожух диска, щоб покрити гострий мікротома лезо, щоб уникнути травм.
5. Orient розділ миші на зразку пластини і розморозити монтажу на попередньо очищене предметне скло мікроскопа, приносячи слайд якомога ближче до секції тканини, не торкаючись до нього 10.
   Примітка: Для кількісного MSI експементи, пальто повзун з внутрішнім стандартом з використанням автоматичного пневматичного розпилювача перед монтажем тканини, і відтавати демонтує зрізи тканини на слайді з покриттям 11.
6. Видаліть мікротома лезо, який використовується для секціонування тканини за допомогою ежектора леза, і безпечно викинути лезо в контейнер "гострі відходи".
7. Тримайте предметне скло всередині кріостату до кроку 3.2 для підтримки кріоконсервації тканини.

2. ІЧ-MALDESI Підготовка / калібрування

1. Увімкніть середньої ІК-лазера і запустити додаток управління лазера на комп'ютері. Виберіть потрібну довжину хвилі за допомогою програми управління лазером, що поставляється виробником. Експерименти ІК-MALDESI зазвичай проводять при 2940 нм.
   Примітка: Недавні експерименти досліджували залежність середнього ІЧ-діапазону довжин хвиль лазерних і матрицю льоду з зазначеними відмінностями, які здаються аналізованих конкретним 8.
2. Увімкніть оленеме контролер, запустіть програму для користувача керування користувач (RASTIR), тваринницьких ферм положення ступені за допомогою кнопки додому.
3. Підготувати електророзпиленням рішення. Як правило, використовують 50:50 (об / об) метанол / вода з 0,2% мурашиної кислоти протягом електророзпиленням розчинника в режимі позитивних іонів. Виберіть композицію електророзпиленням розчинник відповідно до експериментом. Наприклад, можна використовувати 5мМ гідроксид амонію в якості модифікатора електророзпиленням для отримання зображень в режимі негативних іонів.
   Примітка: Для перемикання полярності ІК-MALDESI MSI, використовують 1мМ оцтової кислоти в якості модифікатора. Цей модифікатор був знайдений оптимальний для отримання стабільної і відтворений сигнал в обох позитивно-і негативно-іонних режимах 12.
4. Заповніть 1 мл шприц з розчинником з електророзпиленням, і промивати кварцову капілярну з новим розчинником.
5. Зіставте ESI випромінювач на осі з MS входите, використовуючи дані параметрів джерела, такого як ESI-спот відстань, спот-наливної відстань, висоту зразка, а швидкість потоку розчинника, які були оптимізовані з використанням статистичного DO Е для аналізу зрізів тканини 6. Примітка: На малюнку 1 схематичне зображення цих параметрів і оптимізованих значень для MSI зрізів тканини.
6. Запуск електророзпиленням і оцінити його стійкість (> 10 хв) шляхом моніторингу повного іонного струму (TIC), який, в цьому пункті, складається виключно з зовнішніх з'єднань. Як правило, TIC зміна <10% протягом 10-15 хв є хорошим показником стабільності.

Малюнок 1. ІК-MALDESI схеми і параметри. (A) Схема установки джерела ІК-MALDESI (не в масштабі) і регульованих параметрів. (B) Оптимізовані значення параметрів для отримання зображення зрізів тканини. Будь ласка , Натисніть тут , щоб подивитися збільшену версію цієї фігури.

Назва "> 3. Відкладення Ice Matrix

1. Увага: Вимкніть електрораспиленія перед розміщенням зразка на сцені.
2. Помістіть відтаванні монтажу тканини на зразок пластини IR-MALDESI в поле зору камери.
3. Переконайтеся, що руки вільні від емітера ESI і перезапустити електророзпиленням.
4. Закрийте дверцята джерела і продувки корпусу ІК-MALDESI сухим азотом для запобігання конденсації вологи на поверхні тканини. Після того, як відносна вологість всередині корпусу досягає <3%, включите джерело живлення постійного струму (~ 12 В) до пластини Пельтьє, який буде охолоджувати зразок пластини. Примітка: Процес охолодження в Пельтьє-охолоджувальної стадії детально обговорюється в іншому місці 13.
5. Охолоджують стадії до -9 ° C, і дозволяють змонтований тканини прийти до теплового рівноваги (~ 5-10 хв).
6. Припинити продувку азотом і піддавати тканини до відносної вологості навколишнього середовища, відкривши кришку доступу джерела. Тонкий шар льоду буде осідати на сотруднічествеЛД поверхні предметного столика Пельтьє і змонтований ділянку тканини внаслідок десублімації води з повітря.
   Примітка: Якщо відносна вологість в лабораторії нижче 10-15%, помістіть склянку теплої води всередині корпусу, щоб сприяти формуванню льоду матричного шару.
7. Після того, як лід матричний шар сформований, закрити дверцята і відновити потік сухого азоту, щоб зменшити відносну вологість повітря до 10 ± 2%. Регулювання швидкості потоку азоту, щоб підтримувати відносну вологість на цьому рівні, емпірично встановлено, що баланс утворення льоду і сублімації для підтримки постійного шару льоду протягом усього експерименту 6.

4. Мас-спектрометрія зображень збору даних

1. Використання RASTIR GUI (малюнок 2), перемістіть сцену в позицію аналізу, натиснувши на кнопку "Position" ЛАЗЕР. За допомогою регулювання діод лазера, щоб забезпечити область за межами тканини буде абляції. Пожежа лазерний постріл в УЕ від тканейГіон для калібрування лазера зміщення відносно точки зору камери. Натисніть кнопку "Laser вогневе випробування" для поновлення лазерної позиції.
2. Повернення в положення "CAMERA" і оновити положення лазера в RASTIR шляхом розміщення лазерного вирівнювання візира на лазерної абляції місці (Малюнок 2-1).
3. Натисніть на кнопку область інтересу (ROI) від і відрегулювати розмір і положення ROI для ділянки тканини аналізується (Малюнок 2-2). Вхідні відповідні експериментальні параметри, такі як розмір кроку в X і Y напрямках (в мм) (рис 2-3), а також ім'я файлу MSI в поле "Ім'я проекту" (Малюнок 2-4).
   1. При малюванні ROI, включають в себе частину відходить тканини, яка служить в якості контролю. Використовуйте цей розділ офф-тканини для піку збору (етап 5.4).
      Примітка: Діаметр десорбція (розмір плями) лазера на тканини становить приблизно 150 мкм; Проте, більш високі просторові дозволу можуть бути отримані за допомогою USIнг метод передискретизации 14,15.
4. Виберіть потрібну частоту лазера зі списку, кількість лазерних імпульсів на воксель (цілі значення), а також затримки між лазерним тригером і отримання сигналу мас - спектрометра (Малюнок 2-5). Зазвичай використовують два лазерних імпульсів за воксель при частоті 20 Гц, щоб повністю десорбувати матеріал в експериментах ІК-MALDESI MSI, з часом 10 мс затримки, щоб іони, які генеруються досягти мас - аналізатора для вимірювання 5.
   Примітка: Виберіть найвищу частоту повторення, що лазер може працювати на. Нещодавно було показано, що використання більш високої частоти повторення поліпшить аналіту Виявлення 16.

Малюнок 2. Інтерфейс для роботи ІК-MALDESI MSI. Скріншот програми RASTIR Control Scan представлена. Кроки для перфораціяorming експеримент MSI є (1) місцезнаходження лазерної плями, (2), малювання ROI, (3), вибираючи розмір кроку ступені (в мм), (4), що дає ім'я файлу, (5) вибрати правильний номер імпульсів на воксель поряд з бажаною швидкістю повторення, і (6) перевірки списку для роботи з зображеннями і налаштування MS. Будь ласка , Натисніть тут , щоб подивитися збільшену версію цієї фігури.

1. Виберіть параметри мас-спектрометр, такі як режим іонізації, електрораспиленія напруги, швидкості потоку розчинника, температури капіляра і часу уприскування в програмному забезпеченні мас-спектрометра. Зверніться до Таблиці 1 для прикладу параметрів, використовуваних в усьому тілі ІК-MALDESI MSI.
   Примітка: Через складність біологічних зразків і відсутність методів поділу в MSI аналізу, джерело інфрачервоного MALDESI з'єднаний з високою роздільною здатністю і високою точністю масового інструменту. Спосіб придбання може бути завантажений для Analysес, такі як паралельний моніторинг реакції (PRM) 7 або полярності перемикання MSI 12.
2. Після того, як всі параметри (лазер, етап, і мас-спектрометр) були обрані, помістіть MS в режимі "рукостискання" для синхронізації, і почати придбання MS.
3. За допомогою програмного забезпечення візуалізації RASTIR, перевірте всі кроки в контрольному списку (Малюнок 2-6) завершуються перевірки коробки, і завантажити програму. Після того як програма була завантажена, кнопка "Run" буде доступний. Натисніть Run, щоб почати захоплення сигналу MSI.
4. Після завершення експерименту візуалізації, зупинити масове придбання спектрометра і помістити прилад в режим очікування. Вимкнути продування азотом в корпус, відключіть електроживлення Пельтьє пластини, і вимкніть контролер ступені і лазер.
5. Відкрийте дверцята, зніміть електророзпиленням наконечник емітера з всередині корпусу джерела, і видалити розширену розпеченого металу MS впуск з використанням захисних рукавичок. Увага: розширений метал MS на вході буде дуже жарко.
6. Одягнувши рукавички і захисні окуляри, очистити розширений вхід металу капіляра ультразвукової ванні в 15% -ної азотної кислоти протягом 10 хв, потім в ВЕРХ-очищеної води протягом 10 хвилин, і, нарешті, в ВЕРХ-класу метанолу протягом 10 хв. Сушать вхідний отвір металевий капілярний під потоком азоту, і повернути в робоче MS. Примітка: Утилізувати розчинник у відповідних контейнерах відходів пізніше.

R "стиль =" ширина: 216px; "> 3,8-4,2 кВ ширина: 216px;"> 140000 параметр Вартість Режим Іонізація позитивний Електрораспилітельная напруги Швидкість потоку розчинника 2 мкл / хв Капілярна температури 275 ° C Діапазон сканування м / г 250-1,000 Тип сканування Повне сканування Час упорскування 110 мс Роздільна здатність

Таблиця 1. Параметри приладу, що використовуються в усьому тілі ІК-MALDESI MSI.

1. Перетворення файлів вихідних даних, що генеруються приладом для форматів даних, таких як mzXML 17 або imzML 18 з використанням вільного програмного забезпечення, таких як MSConvert 17 і imzML перетворювача 19.
2. Запустіть MSiReader версії 1.0, програмне забезпечення з відкритим вихідним кодом, розроблений для аналізу високої роздільної здатності даних MSI 20, на виділеному комп'ютері обробки. Завантажте файл зображення на MSiReader. Для призначеного для користувача інтерфейсу MSiReader і деякі з його вбудованих функцій, дивись малюнок 3.
3. Генерація іонних карти аналітов шляхом введення їх m / z і вибрати відповідне вікно m / z в частинах на мільйон (М.Д.) або Томсона (Th) (рис 3-1). Для отримання високої роздільної здатності (RP) інструментоввибрать вікно в діапазоні низьких частин на мільйон.
   Примітка: відповідне вікно м / г залежить від РП і маса точності вимірювань (ММА) інструменту, що джерелом ІЧ-MALDESI з'єднаний.
4. Далі інтерпретувати дані, використовуючи вбудовані функції, такі як інтерполяція (Малюнок 3-2), нормалізація (Малюнок 3-3), оптичний накладається зображення (рис 3-4), і пік, збирання (малюнок 3-5) 20.

Малюнок 3. Інтерфейс MSiReader; Версія 1.0 20. Після того, як файл буде завантажений в програмне забезпечення, іонні карти аналітов відображаються (1) введення m / z і толерантності в проміле або Th. Подальший аналіз, такий як (2) інтерполяції або (3) нормалізації також може бути виконана. Оптичне зображення тканини також можуть бути імпортовані і з наложеннимііонние карти (4) для кращої візуалізації. Для отримання нецільової аналізує пік функції (5) збір може бути використаний для отримання піків тканеспеціфіческіе шляхом вибору ділянки тканини (червоною лінією) і еталонного ділянки офф-тканини (зелений ящик). Будь ласка , Натисніть тут , щоб побачити збільшену версію ця фігура.

1. Використовуйте функцію пікового вибору, щоб створити список тканеспецифических значень m / z з використанням визначених користувачем критеріїв. Примітка: Алгоритм PeakFinder використовує відмінності в середній мас-спектрі двох регіонів. Ці значення m / z, то можна шукати проти метаболіту баз даних, таких як Метлин 21 або липида MAPS. 22
   1. На малюнку 3 показаний приклад вибору регіону допитувана тканини (пурпурного полігон ROI) і поза тканини опорної області (зелений багатокутник ROI).